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文章导读:

1、QTL精细定位及克隆的方法
2、什么是QTL?
3、植物用QTL定位基因的是怎么一个流程
4、QTL定位与经典数量遗传学定位方法相比具有哪些优点
5、标记，定位和克隆作物产量的QTL的方法。
6、QTL分析的一般程序是什么？

QTL精细定位及克隆的方法

QTL 定位就是采用类似单基因定位的方法将QTL 定位在遗传图谱上, 确定QTL 与遗传标记间的距离( 以重组率表示) 。根据标记数目的不同, 可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同, 可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外, 还有将不同方法结合起来的综合分析方法, 如QTL 复合区间作图( CIM) 多区间作图( MIM) 、多QTL 作图、多性状作图( MTM) 等。

1 区间作图法( interval mapping, IM)

Lander 和Botstein( 1989) 等提出, 建立在个体数量性状观测值与双侧标记基因型变量的线性模型的基础上, 利用最大似然法对相邻标记构成的区间内任意一点可能存在的QTL 进行似然比检测, 进而获得其效应的极大似然估计。其遗传假设是, 数量性状遗传变异只受一对基因控制,表型变异受遗传效应( 固定效应) 和剩余误差( 随机效应) 控制, 不存在基因型与环境的互作。区间作图法可以估算QTL 加性和显性效应值。与单标记分析法相比, 区间作图法具有以下特点:能从支撑区间推断QTL 的可能位置;可利用标记连锁图在全染色体组系统地搜索QTL, 如果一条染色体上只有一个QTL, 则QTL 的位置和效应估计趋于渐进无偏; QTL 检测所需的个体数大大减少。但IM也存在不足: QTL 回归效应为固定效应;无法估算基因型与环境间的互作( Q×E) , 无法检测复杂的遗传效应( 如上位效应等) 当相邻QTLs 相距较近时, 由于其作图精度不高, QTLs间相互干扰导致出现Ghost QTL;一次只应用两个标记进行检查, 效率很低。

2 复合区间作图法( composite interval mappig, CIM)

CIM是Zeng( 1994) 提出的结合了区间作图和多元回归特点的一种QTL 作图方法。其遗传假定是, 数量性状受多基因控制。该方法中拟合了其他遗传标记, 即在对某一特定标记区间进行检测时, 将与其他QTL 连锁的标记也拟合在模型中以控制背景遗传效应。CIM主要优点是: 由于仍采用QTL 似然图来显示QTL 的可能位置及显著程度, 从而保证了IM作图法的优点; 假如不存在上位性和QTL 与环境互作, QTL 的位置和效应的估计是渐进无偏的; 以所选择的多个标记为条件( 即进行的是区间检测) , 在较大程度上控制了背景遗传效应, 从而提高了作图的精度和效率。存在的不足是: 由于将两侧标记用作区间作图, 对相邻标记区间的QTL 估计会引起偏离; 同IM一样, 将回归效应视为固定效应, 不能分析基因型与环境的互作及复杂的遗传效应( 如上位效应等) 当标记密度过大时, 很难选择标记的条件因子。

3 基于混合线性模型的复合区间作图法

朱军( 1998) 提出了用随机效应的预测方法获得基因型效应及基因型与环境互作效应, 然后再用区间作图法或复合区间作图法进行遗传主效应及基因型与环境互作效应的QTL 定位分析。该方法的遗传假定是数量性状受多基因控制, 它将群体均值及QTL 的各项遗传效应看作为固定效应, 而将环境、QTL 与环境、分子标记等效应看作为随机效应。由于MCIM将效应值估计和定位分析相结合, 既可无偏地分析QTL 与环境的互作效应, 又提高了作图的精度和效率。此外该模型可以扩展到分析具有加×加、加×显、显×显上位的各种遗传主效应及其与环境互作效应的QTL。利用这些效应值的估计, 可预测基于QTL 主效应的普通杂种优势和基于QTL 与环境互作效应的互作杂种优势, 因而其具有广阔的应用前景。

几种作物的QTL 定位利用不同的实验设计、作图群体和作图方法, 人们已对许多植物如棉花( Sarangaetl, 2001) 、大豆( Venancioetal, 2001) 、油菜( Piletetal, 1998) 、小麦( Messmeretal, 2000) 、玉米( Tuberosaetal, 2002) 、苹果( Conneretal,1998) 、松树( Paivietal, 2000) 等植物的重要数量性状进行了QTL 定位研究, 相比之下, 模式植物水稻、拟南芥等研究得较多、较深( Leonie, 2000;Yamamotoetal, 2000; 邢永忠等,2001;Fukuoka and Okuno, 2001; 滕胜等,2002) 。进行QTL 定位的主要农艺性状有: 谷物产量、生育期、株高、根的形态、谷粒外观品质和食味品质、稻瘟病部分抗性、纹枯病抗性, 以及抗非生物逆境等复杂性状。如番茄的抗病性、抗虫性( Yenchoetal, 2000;Davidand Sara, 2001; Danieltal, 2002) 、可溶性固形物含量、水分利用率、耐盐性等性状, 玉米的株高和耐热性, 大豆品质性状, 油菜硼高效( Xuetal, 2001) 等性状, 拟南芥光周期、种子可溶性寡糖及种子储藏能力( Leonieetal, 2000) , 水稻耐( Koyamaetal, 2001) 、耐低磷( Wissuwaetal,1998) 、耐铝毒害( Wuetal, 2000) 、N 素营养( Yamayaetal, 2002) 、抽穗期、抗病性、粒形、根的形态、耐冷性、杂种优势、雄性不育、产量及其构成因素、耐淹性、稻头再生能力、种子休眠性等。

QTL 精细定位

数量性状基因的精确定位存在很大的难度, 因为利用一般群体进行QTL 定位, QTL 的置信区间通常在10 cm 以上, 很难确定检测到的一个主效QTL 到底是一个还是多个微效QTL。要系统地开展QTL 的精细定位, 就应该建立一套覆盖全基因组的相互重叠的染色体片段替代系或近等基因系, 也就是在一个受体亲本的遗传背景中建立另一个供体亲本的“基因文库”。构建近等基因系, 首先需要对QTL 有初步定位, 再结合回交和分子标记辅助选择, 对QTL 靶区间进行正选择, 对背景进行负选择, 从而快速构建靶区间的近等基因系。如果创建一套覆盖全基因组的染色体片段的替代系, 将对QTL 精细定位提供非常便利的条件。目前, 番茄和十字花科物种中已建立起这样的替代系。应用染色体片段替代系, 已成功地对水稻抽穗期QTL 进行了精细定位, 分辨率超过0.5 cm。

QTL 的基因克隆

对QTL 研究的最终目标应是将QTL 上的基因克隆分离出来, 亦即对数量性状进行分子剖析。以基因定位为基础的基因克隆技术, 称为基于图谱的克隆( map based cloning) 或图位克隆( positional cloning) 图位克隆特别适合于分离产物未知的基因( 如QTL) , 主要采用染色体步行法。迄今, 图位克隆技术已成功地应用于分离一些主基因, 如番茄中的抗病基因和拟南芥菜中的光周期敏感基因和对番茄果重QTL( fw2.2) 的克隆分离, 并业已获得了包含fw2.2 的DNA 大片段。研究结果表明fw2.2 可能只包含一个基因。RGP 也正在对一个控制水稻抽穗期的主效QTL 进行图位克隆。近来, 有学者提出可以从与目标性状松散连锁的标记出发,通过标记与目标基因的距离换算成物理距离, 再根据物理图谱推算, 一杆即可到达可能包含目标基因的重叠群, 再从该重叠群中分离单拷贝的片段作为RFLP 探针, 对目标基因进行定位, 倘若定位的结果不在该重叠群上, 则可续第二杆, 如此继续下去, 直到分离到含有目标基因的克隆为止。此法称为高尔夫球法( 喻树迅和袁有禄, 2002) 。最近有将原位杂交( FISH) 技术应用到QTL 定位中的报道, 随着FISH 技术的发展, 它势必为QTL 克隆提供一个强有力的工具。此外, 还可以利用生物信息学的方法, 根据已有的与目标基因紧密连锁的分子标记进行染色体着陆, 很快得到基因区域的序列, 再进行候选基因的确定, 从而可以减少区段物理图谱的构建工作, 加速目标基因克隆进程。

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什么是QTL?

QTL是quantitative trait locus的缩写，中文可以翻译成数量性状座位或者数量性状基因座，它指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置。对QTL的定位必须使用遗传标记，人们通过寻找遗传标记和感兴趣的数量性状之间的联系，将一个或多个QTL定位到位于同一染色体的遗传标记旁。

换句话说，标记和QTL是连锁的。近几年QTL定位应用的较为广泛，在人类基因上与疾病有关的基因定位甚多；植物上，模式植物抗逆性基因的定位较多。国内在家畜基因组学上的QTL专家有中国农业大学的张勤教授、华中农业大学的熊远著院士。

QTL定位的作图方法

QTL定位就是采用类似单基因定位的方法将QTL定位在遗传图谱上，确定QTL与遗传标记间的距离（以重组率表示）。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。

根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如QTL复合区间作图（CIM）多区间作图（MIM）、多QTL作图、多性状作图（MTM) 等。

植物用QTL定位基因的是怎么一个流程

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作者：刘漠雅

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来源：知乎

首先根据所研究基因表型性状建立群体，一般是RIL群体、DH群体和F2群体，然后将群体及亲本在多个年份和多个环境下种植，以获得该群体的表型数据。然后选择SNP（较贵）或者SSR标记对该群体进行基因型检测。利用joinmap等软件结合遗传书局作图，利用QTLCart或者Icimapping进行QTL定位，可以分析每个QTL的遗传效应。

QTL定位与经典数量遗传学定位方法相比具有哪些优点

通常QTL粗定位所需群体较小，一般200个左右株系的群体即可，RIL、DH和F3等群体都可以进行；精细定位通常需要群体要大，一般需要上千个株系，有的甚至上万，对于质量性状基因选用F2群体的单株进行分析，而数量性状基因则需利用RIL或DH群体的粗定位结果进行次级群体的构建，然后才可进行基因的精细定位。

标记，定位和克隆作物产量的QTL的方法。

QTL 定位方法

分子标记技术和数量遗传学的发展，使得分子遗传学与数量遗传学相互渗透和融合，从而形成了一个新的研究领域—分子数量遗传学（Molecular Quantitative Genetics）。分子数量遗传学研究的内容，就是借助分子标记，采用适当的统计分析方法明确QTL 在染色体上的位置及其效应。而QTL 定位的原理是：利用适当的分离群体，构建较高密度的、分布较均匀的、覆盖全基因组的分子标记连锁图。根据遗传连锁的基本遗传学原理，对分离群体中单株的标记基因型和性状的表型值进行一定的统计分析，将决定数量性状的QTL 定位在分子标记连锁图中。目前，QTL 定位的方法主要有单标记分析法（Edwards et al, 1987），区间作图法（Lander and Botstein, 1989）和复合区间作图法（Zeng, 1994）等。

单标记法（Single marker analysis）是最简单的分析标记与性状关联的方法，包括以标记为基础的分析方法（Marker-based analysis, MBA）和以性状为基础的分析方法（Trait-based analysis, TBA，Lebowitz et al., 1987）。前者利用每个标记位点不同基因型间的性状均值差异，以传统的单因素方差分析法测验被研究的数量性状在标记基因型间的差异显著性。对于一个作图群体而言，任意标记位点具有三种基因型（F2 群体）或两种基因型（回交群体、重组自交系、双单倍体系），分析每一基因型个体的数量性状均值的差异，并进行F 测验，当F 测验显著时，则表明该标记位点可能与一个或多个QTL 连锁。利用这种方法进行的数量性状分析，既简单又符合QTL 定位的基本统计原理，且不需要完整的分子标记连锁图，是定位QTL 的最为有效方法。但不足之处是不能准确估计QTL 的位置，且往往会低估其遗传效应。以性状为基础的分析方法的原理是假定因选择而使数量性状的高表型个体中的QTL 增效等位基因和低表型个体中的QTL 减效等位基因的频率增加，当QTL 的等位基因与某一标记基因连锁时，会因相互关联而导致高、低表型个体间标记基因频率的差异。Lebowitz 等（1987）提出了3种试验设计用于这类以性状为基础的QTL 分析。这类方法的优点是较适合于同育种和选择试验相结合的分析研究。单标记法在20世纪80年代初应用的较多。

区间作图法（Interval Mapping, IM）原理是以饱和连锁图谱为基础，以正态混合分布的极大似然函数和线性回归模型对目标性状作全基因组扫描，对任意两个相邻标记位点及其间任一位点上是否存在对该性状有效应的位点进行判别。各位点对性状的效应大小由似然值（LOD 值）指示，根据似然值描绘的曲线图确定QTL 可能的染色体位置。LOD 值等于机率（OR, odds ratio）的常用对数，OR实质上为两个相邻标记位点及其间任一位点存在QTL与不存在QTL 的概率之比。此方法具有以下优点∶1）利用相邻标记的信息，从而可以获得该区间所有位点与QTL 的最大连锁信息进而可以完成整个基因组任意位点的测试；2）通过LOD 支持区间确定QTL 的存在位置；3）检测QTL 所需的个体数相对较少；4）若一条染色体上只存在一个QTL，则QTL 的定位和估计是比较准确的。此方法可以同时利用两个相邻标记的分离信息，定位的QTL 较单标记分析定位的位置准确，因而得到广泛的应用（Paterson et al., 1988; Yano et al., 1997; Tanksley et al., 1992; Li et al., 1995; Yu et al., 1997）。虽然区间作图法与单标记分析法相比具有明显的优点，但它仍然存在一些问题：1）区间内任意三点测验并不是独立于区间外的，它受其他位点的影响，即使某一区域没有QTL，但于其附近区域的QTL 效应，在原本不存在QTL 的地方可能被确定存在一个QTL；2）如果一条染色体存在多个QTL，这种估计QTL 的方法将产生偏差；3）每次只用两个标记来检测，影响了检测效率。

复合区间作图（CompositeInterval Mapping, CIM）是在区间作图的基础上发展起来的（Zeng, 1994）。选择多个可能的QTLs 作为背景干扰进行分析，求出特定QTL 与性状间的偏回归系数来判断QTL 存在与否。此法充分利用统计控制，使一个区间的测定不受定义区间以外的其它标记和QTL 影响，减少了剩余方差，提高了检测QTL的能力。不足之处在于该法可能使统计量的测验显著水平降低，影响QTL 检出效率。在复合区间作图法的基础上，有不少学者进一步提出了改进和创新，其中浙江大学朱军教授领导的研究小组作了富有成效的工作，提出了用随机效应的预测方法获得基因型效应及基因型×环境互作效应的QTL 定位分析方法，还给出了发育性状的条件QTL 定位分析方法，进而提出了包括加性效应、显性效应、上位性及其与环境互作效应的混合线性模型复合区间作图法（Multiple-trait Composite Interval Mapping, MCIM, Zhu, 1995; Shi et al,1997; Yan et al, 1998; Yan et al, 1999; Zhu and Weir, 1998; Wang et al, 1999）。其中，Wang等（1999）开发的基于混合线性模型的复合区间作图方法，可以分析DH 或者RIL 群体加性和加性×加性上位性的各项遗传主效应及其与环境互作效应，并可以扩展到分析具有加×加、加×显、显×显上位性的各项遗传主效应及其与环境互作效应的QTL。应该说，迄今为止，复合区间作图法仍然是应用最为广泛的方法之一。值得提及的是，不管是单标记法、区间作图方法还是复合区间作图法，对效应较大的QTL 分析结果都具有较好的同一性，表明这些方法都是可行的。

针对QTL 定位的研究大多只局限于分析数量性状在个体发育中某个时期的表现的缺点，Wu 等(1999)提出了一种新的QTL 定位策略和方法，即动态定位法(Dynamic Mapping)。利用该法进行的以水稻分蘖为模式性状的研究结果表明，它可有效地利用性状发育过程中的遗传信息，大幅度提高QTL 定位的灵敏度和准确度，从而使QTL 定位研究进入到发育数量遗传学这个新领域。

QTL作图软件有多种，其中以Windows QTL Cartographer V2.0和Mapmaker/QTL及QTLmapper 1.6的使用广泛。